PCR檢測常見問題之假陽性分析

 　　PCR檢測常見問題之假陽性分析
　　利用PCR方法檢測轉基因成分時，經常出現假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結果得出錯誤結論，有時可造成嚴重后果。為了提高轉基因檢測的準確性和可靠性，PCR檢測應盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶現象的發(fā)生。一個好的PCR方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復性、重現性、魯棒性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴增。
　　本文對PCR檢測中出現的假陽性原因進行分析
　　（一）假陽性現象
　　假陽性是指檢測陰性材料得到陽性結果。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現一個或幾個陽性結果，提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現。
　　（二）造成假陽性的原因
　　1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；
　　2. PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
　　3. PCR擴增產物污染：這是PCR反應中zui主要zui常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。
　　4. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
　　5. 實驗室中克隆質粒的污染：由于克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題比較常見。